Plačiai auginamos žuvies Labeo rohita peptidų atlasas: akvakultūros bendruomenės šaltinis

Žuvies rinkimas ir aklimatizacija

Trijų mėnesių sveikas L. rohita maždaug 10 ± 2 g svorio pirštai buvo paimti iš ICAR-CIFE Powarkheda regioninio centro, Madja Pradeše, Indijoje. Laboratorinės sąlygos, naudojamos pirštų aklimatizacijai, buvo vėdinimas 24 valandas, dienos šviesa 12 valandų, 10% vandens mainai per dieną, vandens temperatūra 28–30 ° C ir maitinimas du kartus po 2% kūno svorio. Po septynių dienų aklimatizacijos penkios sveikos žuvys buvo patalpintos į akvariumą badavimo sąlygomis vienai dienai, po to eutanazuotos mėginiams paimti. Kaip parodyta 1 lentelėje, buvo paimta devyniolika skirtingų tipų mėginių, kuriuose yra vienas viso embriono audinio mėginys, kraujo plazma ir 17 audinių. Penkiolika audinių buvo paimti iš pirštų, o plazma ir lytinių liaukų audiniai iš suaugusių žuvų. Kraujo plazma buvo paimta iš žuvų patelių, o embrionai buvo paimti po keturių dienų apvaisinimo. Paimti mėginiai buvo laikomi -80 ° C temperatūroje iki tolesnio naudojimo.

1 lentelė Audinių tipai ir išsami informacija apie mėginių ėmimą.

Baltymų ekstrahavimas, skirtas nuodugniam proteominiam profiliavimui

Baltymams išgauti iš atskirų žuvų paimti organų mėginiai buvo sujungti ir perkelti į priekį. Audinių lizavimui naudojamas karbamido buferis, kuriame yra 8 M karbamido, 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2 ir buvo naudojamas 75 mM NaCl. Penkiolikai audinių, įskaitant blužnį, nugaros smegenis, odą, žvynus, raumenis, vyrų lytinius liaukas, kepenis, inkstus, širdį, žarnas, žiaunas, moterų lytinius liaukas, akis, smegenis ir oro pūslę, pH poslinkio tirpinimo metodas20 buvo naudojamas baltymų ekstrahavimui. Šiems audiniams baltymai buvo ekstrahuojami naudojant karbamido buferį trijų skirtingų pH, ty pH 2,5, 8 ir 13. Į maždaug 75–100 mg audinių mėginio buvo pridėta 300 µl lizės buferio, po to 2–3 kartus apdorota ultragarsu (Vibra -Cell™ Ultrasonic Liquid Processors, VCX 130 (Sonics). Mėginys 90 s plakamas naudojant cirkonio / silicio granules (kat. Nr. 11079110z). Po to centrifuguojamas 8000 aps./min 4 °C temperatūroje 15 min. gauti skaidrų supernatantą, kuriame yra baltymų. Embriono mėginiui visi embrionai buvo apdoroti Trizol metodu21 baltymų ekstrahavimo. Plazmos mėginiai buvo imami tiesiogiai (be jokio išeikvojimo) tolesniam tyrimui.

Baltymų kiekybinis nustatymas ir kokybės patikrinimas SDS-PAGE

Baltymų kiekybinis nustatymas buvo atliktas Bradfordo baltymų tyrimu, naudojant galvijų serumo albuminą (BSA) kaip standartą. Atitinkamai, absorbcija buvo paimta esant 595 nm ir standartinė kreivė buvo nubraižyta naudojant BSA skiedimus ir buvo nustatyta visų nežinomų mėginių koncentracija. Siekiant patikrinti baltymų ekstrakto kokybę, buvo atliktas 1 matmens SDS-PAGE, kurio metu kiekvienam mėginiui buvo įdėta 15 ug baltymų ant mini vertikalaus gelio (Bio-Rad Mini PROTEAN® 3 Cell, Bio-Rad Laboratories). , pagal Laemmli protokolą22. Kadangi ekstrahuotas baltymas buvo karbamido turinčiame buferyje, prieš SDS-PAGE nebuvo atliktas joks kaitinimo etapas, kad būtų išvengta karbamilinimo rizikos. Gelio elektroforezė buvo atliekama 1-2 valandas, po to dažoma Coomassie blue R350 tirpalu metanolyje ir acto rūgštyje. Gelis buvo pašalintas, kad būtų galima pamatyti baltymų juostas (papildomas S1a pav.).

Frakcionavimas, virškinimas gelyje ir peptidų paruošimas

Virškinimui gelyje 30 µg baltymų iš kiekvieno mėginio buvo tiriamas SDS-PAGE, kaip nurodyta aukščiau. Kiekvienas mėginys buvo paimtas dviem egzemplioriais ir iškirptos mažiausiai šešios juostelės (1a pav.). Plazmos mėginiui buvo apdorota 11 gelio frakcijų, kad būtų galima virškinti gelyje. Elektroforezė buvo atliekama tik 30–40 minučių, ty ~ 1 cm skiriamajame gelyje. Prieš atliekant baltymų virškinimą, dėmė buvo pašalinta, po to baltymų redukcija ir alkilinimas. Norėdami pašalinti dėmes nuo gelio gabalėlių, alternatyviai apdorokite buferine druska amonio bikarbonatu (NH4HCO3) ir atliktas organinio tirpiklio acetonitrilo (ACN) tirpalas. Baltymai buvo redukuoti naudojant ditiotreitolį (DTT) ir alkilinti naudojant jodoacetamidą (IAA). Baltymų virškinimui tripsinas buvo naudojamas ~ 1:30 fermento ir baltymų (m/m) santykiu. Peptidai buvo ekstrahuoti iš gelio gabalėlių po 16–18 valandų virškinimo, naudojant didėjantį ACN tirpalo gradientą. Peptidai buvo pašalinti naudojant C18 Empore™ SPE Disks matricą (Merck). Peptidų kiekybinis nustatymas buvo atliktas naudojant Scopes metodą23 ir vienam µg peptido buvo atlikta masės spektrometrinė analizė.

Fig. 1
figūra 1

Eksperimentinio projektavimo ir analizės darbo eigos apžvalga. (a) Žuvys buvo išpjaustytos, kad būtų paimti audiniai / mėginiai, po to ekstrahuotas baltymas ir SDS-PAGE. Gelio gabalėliai buvo iškirpti ir apdoroti triptiniam skaidymui gelyje, po to buvo atlikta skysčių chromatografijos tandeminė masės spektrometrija (LC-MS / MS) ir analizė trans proteominiame vamzdyne (TPP), (b) Neapdoroti duomenys, gauti iš DDA-MS, buvo apdoroti dujotiekyje kuriant PeptideAtlas. Neapdoroti failai pirmą kartą buvo konvertuoti į mzml, po to sekė kometų paieškos ir analizės dujotiekis, įskaitant peptidų pranašą, reSpect, iPROphet, baltymų pranašą ir galutinį filtravimą bei patvirtinimą, kad būtų sudarytas atlasas.

Nuo duomenų priklausomas gavimas naudojant skysčių chromatografijos tandeminę masių spektrometriją (LC-MS / MS)

„Easy-nLC“ nano srauto skysčių chromatografijos 1200 sistema buvo naudojama peptidams atskirti po skaidymo gelyje (1a pav.). Esant 5 µl/min srauto greičiui, vienas µg nusūdytų peptidų buvo įkeltas į išankstinę analizę (Thermo Scientific, PN 164564-CMD, Trap kolonėlė nanoViper C18, 5 µm, 100 cm Å, Acclaim PepMap 100-100 µm ). Peptidai buvo paleisti 120 min. gradientu tirpiklyje B, kuris buvo 80% ACN tirpalas su 0,1% skruzdžių rūgštimi (FA). Srauto greitis buvo palaikomas kaip 300 nl / min, kad būtų galima išskirti peptidus analizės kolonėlėje (Thermo Scientific, PN ES903, C18-75 μm × 50 cm, 2 μm dalelė, PepMap RSLC, 100 Å porų dydis). Masės spektrometriniai duomenys buvo gauti naudojant Orbitrap masės analizatorių DDA režimu visame skenavimo diapazone 375–1700 m / z esant 60 000 masės skiriamajai gebai. Dinaminiam išskyrimui masės tolerancija buvo nustatyta kaip ± 10 40 s, o MS2 pirmtakų izoliacijos masės langas buvo nustatytas į 1, 2 Da. MS / MS suskaidymui buvo naudojamas didelės energijos susidūrimo disociacijos (HCD) metodas. MS1 ir MS2 AGC tikslas buvo nustatytas atitinkamai 400 000 ir 10 000. Teigiamam vidiniam kalibravimui buvo naudojama 445,12003 m/z užrakto masė.

Masės spektrometriniai duomenys, naudojami šiame tyrime kuriant PeptideAtlas of Labeo rohita buvo naudojamas potransliacinių modifikacijų (PTM) profiliavimui iš audinių ir lyginamajai baltymų ekspresijos analizei, kaip buvo pranešta mūsų naujausiame tyrime.24.

Baltymų identifikavimas, TPP analizė ir PeptideAtlas surinkimas

Neapdoroti masės spektrometrijos duomenys (.raw), sugeneruoti iš Orbitrap Fusion masės spektrometro, buvo konvertuoti į .mzML failus naudojant MSconvert 3.0.5533 įrankį25. Konvertuotų mzML failų buvo ieškoma naudojant Comet (2019.01 rev.1)26 priemonė prieš L. rohita NCBI baltymų duomenų bazė. Šią duomenų bazę sudarė baltymų sekos, sukurtos transliuojant koduojančias sekas (CDS) naudojant genų prognozes po viso genomo sekos nustatymo.Labeo rohita (Bio projektas: PRJNA437789). Duomenų bazėje buvo lokuso žymų ID (priešdėlis Rohu_) ir EMBL / Bank / GenBank / DDBJ CSS ID (priešdėlis RXN). Šios rūšies UniProt duomenų bazėje (ProteomeID-UP000290572) yra kiekvieno CD UniProt baltymo identifikatorius. NCBI duomenų bazėje buvo 32687 įrašai ir UniProt duomenų bazė, kuri buvo atsisiųsta 16th 2019 m. rugpjūčio mėn. yra 32 379 įrašai ir yra NCBI duomenų bazės poaibis. Pradinei kometų paieškai buvo naudojama NCBI duomenų bazė, o visi tolesni veiksmai, įskaitant baltymų identifikavimą ir PeptideAtlas surinkimą, buvo atlikti naudojant kombinuotą NCBI ir UniProt duomenų bazę. Mes panaudojome kombinuotą duomenų bazę, kad baltymai, kurie dar neįtraukti į UniProt duomenų bazę, taip pat galėtų būti įtraukti į PeptideAtlas kūrimą.

Į baltymų duomenų bazę buvo įtrauktas vienodas skaičius jaukų ir teršalų sekų. Apgaulės sekos buvo sukurtos naudojant „atsitiktinių sekų ir tarpinių įrašų“ apgaulės algoritmą, o teršalų sekos buvo paimtos iš bendros atsitiktinių baltymų saugyklos, cRAP, duomenų bazės (//www.thegpm.org/crap/). Trans-proteomic Pipeline (TPP) rinkinio duomenų analizei naudojami parametrai apima peptidų masės toleranciją 20 ppm, fragmentų jonų talpyklos toleranciją 0,05m / z ir monoizotopinės masės poslinkis 0,0m / z, du leidžiami praleisti skilimai, visiškai triptiniai ir pusiau triptiniai peptidai, triptofano ir metionino oksidacija (+15,994915 Da) kaip kintamos modifikacijos ir cisteino karbamidometilinimas (+57,021464 Da) kaip statinė modifikacija. Baltymų identifikavimas buvo atliktas naudojant TPP V 5.2.0 Flammagenitus27. Norint įvertinti peptidų spektrinę atitiktį (PSM), atskiriems failams buvo naudojami integruoti PeptideProphet ir iProphet įrankiai, o kombinuotuose PeptideProphet failuose buvo įvertinti unikalūs peptidai. Galiausiai „ProteinProphet“ įrankis buvo naudojamas baltymų identifikavimui pagal „iProphet“ įvestį, o tikrosios identifikacijos buvo pasirinktos esant mažesniam nei 1% FDR.28,29,30. Visa darbo eiga pavaizduota Fig. 1b.

Chimeriniai spektrai buvo pasiekti iš naujo išanalizavus iProphet failus naudojant reSpect algoritmą31. Trumpai tariant, reSpect paieška buvo atlikta iProphet failuose, padidinus pirmtakų masės toleranciją iki 3,0 Da. TPP analizė buvo atlikta kaip minėta anksčiau, o ReSpect ir TPP analizės procesas buvo pakartotas vieną kartą. ReSpect paieškai buvo naudojama mažiausia iProphet tikimybė ≥ 0,0. „PeptideAtlas“ apdorojimo dujotiekis buvo naudojamas „PeptideAtlas“ kūrimui, derinant „iProphet“ rezultatus iš įprastų TPP ir „ReSpect“ paieškos rezultatų. Spektras buvo filtruojamas kintama tikimybe, kad kiekvienam eksperimentui būtų gautas pastovus peptidų spektro atitikimo (PSM) FDR 0,0008%. Statistiškai reikšmingi rezultatai buvo susisteminti „Rohu PeptideAtlas“, kurį sukuria ir prižiūri ISB nurodytoje nuorodoje. http://www.peptideatlas.org/builds/rohu/.

Identifikuoto proteomo ortologinė analizė

Visų kanoninių baltymų ortologinė analizė buvo atlikta naudojant EGGNOG kartografo genomo funkcinės anotacijos įrankį32 (http://eggnog-mapper.embl.de/). Pirma, FASTA sekos buvo gautos iš UniProt33 visų baltymų ID ir laikomi įvesties sąrašu (papildoma S1 lentelė). Šios analizės metu taksonominė apimtis buvo pasirinkta kaip Actinopterygii, ortologijos apribojimai pasirinkti kaip „perkėlimo anotacija iš bet kurio ortologo“, sėklos ortologo aptikimo kriterijai buvo nustatyti kaip 0, 001.

Pasirinktų reakcijos stebėjimo (SRM) duomenų gavimas tikslinei patikrai

Tiksliniai proteominiai duomenys buvo gauti naudojant Thermo TSQ Altis Triple Quadrupol Mass Spectrometer, susietą su Thermo Vanquish HPLC sistema. Duomenys buvo gauti naudojant SRM / MRM (Pasirinktos / kelių reakcijų stebėjimo) gavimo režimą. Atvirkštinės fazės peptidų atskyrimui buvo naudojama Hypersil GOLD analitinė kolonėlė (Thermo Fisher Scientific, 100 × 2 mm, C18). Mėginiai buvo paleisti 450 µl/min srauto greičiu. Vienas µg nudruskinto peptido mėginio buvo patalpintas į kolonėlę ir paleistas 10 minučių. Naudojamą skysčių chromatografijos sistemą sudarė 0,1 % skruzdžių rūgšties (FA) miliQ vandenyje kaip tirpiklis A ir 80 % acetonitrilo (ACN) ir 0,1 % FA kaip tirpiklis B. Viso veikimo metu kolonėlės temperatūra buvo nustatyta 45 °C. οC ir ciklo laikas buvo laikomi 2 s. Skyline kasdieninė programinė įranga34 (versija 20.2.1) buvo naudojama duomenų analizei.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.